飞诺美色谱-猪肉中齐帕特罗残留量的分析方法

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　　飞诺美色谱-猪肉中齐帕特罗残留量的分析方法：
　　
　　AF10090
　　
　　应用及技术服务部
　　
　　摘要：本实验以 SN/T 2624-2010 为依据，采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱(SPE-LC/MS/MS) 的方法，在多反应监测(MRM)模式下建立了猪肉中齐帕特罗的检测方法。样品中的齐帕特罗经 乙腈、异丙醇和柠檬酸缓冲液的混合溶液提取，Cleanert PEP-2 串联 Cleanert PCX 固相萃取柱 净化，Venusil  MP C18 色谱柱（2.1 × 50mm，3 μm ，100 )分离，0.1%甲酸水 ︰ 0.1%甲酸乙 腈(95 ︰ 5, V/V)为流动相进行等度洗脱，外标法进行定量。结果表明，齐帕特罗添加量为 4.0 μg/kg 时，回收率在 90% ~ 110%之间，能够满足检测要求。
　　
　　关键词：SPE-LC/MS/MS；齐帕特罗；Cleanert PEP-2 SPE 柱；Cleanert  PCX  ；Venusil MP C18 色谱柱
　　
　　前言
　　
　　齐帕特罗(zilpaterol)属于 β2-肾上腺素受体激动剂，是一种与克伦特罗(俗称瘦肉 精)、莱克多巴胺、沙丁胺醇等具有同样生理效应的生长促进剂，属于违禁药物。但 其化学结构却与常见的 β-兴奋剂不同,其毒性也是莱克多巴胺的 15 倍。然而，随着 相关兽药监管部门对克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等常见 β-兴奋剂打击力度的 增大和相关检测技术的日趋成熟，齐帕特罗极有可能被不法分子利用，成为食品安 全的潜在杀手。SN/T 2624-2010《 动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》规定受体激动剂最低检测限为 0.5 μg/kg。
　　
　　实验部分
　　
　　仪器、试剂与材料
　　
　　主要仪器设备
　　
　　AB SCIEX API 4000+液相质谱联用仪 试剂材料
　　
　　甲醇、氨水、乙腈、甲酸均为色谱纯；实验用水为超纯水；柠檬酸为分析纯；
　　
　　齐帕特罗标准品（纯度大于98%），甲醇溶解并稀释；
　　
　　柠檬酸缓冲液：称取 10.5 g 溶解于 500 mL 水中，用氨水调节 pH 至 2.5； 甲醇-氨水（95/5,V/V）；
　　
　　水-甲醇（95/5,v/v）；
　　
　　0.1%甲酸水-甲醇溶液（95/5,v/v）；
　　
　　一次性无菌注射器；尼龙针式过滤器(0.22 μm，直径 13 mm)； Cleanert PEP-2 固相萃取柱：60 mg/3mL；
　　
　　Cleanert PCX 固相萃取柱：60 mg/3mL
　　
　　样品制备
　　
　　样品提取
　　
　　准确称取 5 g 均质猪肉试样于 50 mL 离心管中，加入 30 mL 乙腈，2 mL 异丙醇 和 10 mL 柠檬酸缓冲液，涡旋混合提取 3 min ，8000 r/min 离心 3 min，上清液转移 至 250 mL 梨心瓶中。重复上述提取操作，合并提取液，加入 6 mL 异丙醇后，在40℃ 旋蒸浓缩至 5 mL 左右，转移浓缩液至 50 mL 离心管中，并用5 mL 柠檬酸缓冲液润 洗梨心瓶，合并洗液，8000 r/min 离心 10 min，取清液待净化。
　　
　　样品净化
　　
　　取 PEP-2 (60 mg/3 mL)  和 PCX (60 mg/3 mL)，用转接头按从上到下的顺序串联 好，依次用 3 mL 甲醇、3 mL 水、3 mL 柠檬酸缓冲液活化小柱，待净化液以 0.5 mL/min 流速全部过柱，再依次用 3 mL 柠檬酸缓冲液、3 mL 水、3 mL 水-甲醇(95/5,V/V)淋 洗小柱，抽干 5 min，最后依次用 4 mL 甲醇、6 mL 甲醇-氨水(95/5,V/V)洗脱小柱， 合并收集洗脱液，40℃氮气浓缩至干，加入 1.0 mL 0.1%甲酸水-甲醇溶液(95/5,V/V) 振荡溶解残渣，过 0.22 μm尼龙针筒过滤器，待测。
　　
　　注：上述操作步骤可在 Qdaura卓睿全自动固相萃取仪上完成。
　　
　　实验条件
　　
　　液相条件
　　
　　色谱柱：Venusil  MP C18 ，2.1 × 50mm ，3 μm，100 ; 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液，B相-0.1%甲酸乙腈；
　　
　　柱  温：30℃;   进样量：10 μL；
　　
　　流速：300 μL/min；
　　
　　等度洗脱：0~10 min ，A  ︰ B = 95  ︰ 5 (V/V)。 质谱条件
　　
　　离子源：电喷雾离子源； 扫描方式：正离子扫描； 电喷雾电压：4500 V；
　　
　　雾化气压力：40 psi； 气帘气压力：15 psi； 辅助气压力：40 psi； 离子源温度：400℃;
　　
　　采集方式：多反应监测(MRM)； Q1 、Q3均为单位分辨率；
　　
　　质谱参数(见表1)

结论

      本实验建立了齐帕特罗残留量的 LC-MS/MS 检测方法，并结合固相萃取技术对 猪肉中齐帕特罗的含量进行了测定。对于加标量为 4.0 μg/kg 的样品进行了检测，回 收率在 90% ~ 110%，符合国标要求，固相萃取方法稳定并且色谱柱重现性良好，说 明本方法能够用于检测动物源性食品中齐帕特罗的残留量。